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Jun 20, 2023

Fusione di particelle di super

Scientific Reports volume 13, numero articolo: 13327 (2023) Cita questo articolo 1591 Accessi 2 Dettagli metriche alternative La microscopia di localizzazione di singole molecole offre una risoluzione quasi fino al

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 13327 (2023) Citare questo articolo

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La microscopia di localizzazione di singole molecole offre una risoluzione quasi fino al livello molecolare con un'etichettatura molecolare specifica ed è quindi uno strumento promettente per la biologia strutturale. In pratica, tuttavia, il valore effettivo di questo campo è limitato principalmente dalla marcatura fluorescente incompleta della struttura. Queste informazioni mancanti possono essere completate unendo le informazioni di molte particelle strutturalmente identiche in un approccio di fusione delle particelle simile all'analisi crio-EM di singola particella. In questo articolo, presentiamo un'analisi dei dati dei risultati della fusione delle particelle delle nucleoporine Nup96 marcate in modo fluorescente nel complesso dei pori nucleari per mostrare che Nup96 si presenta in una disposizione spaziale di due anelli di 8 unità con due copie di Nup96 per unità per un totale di 32 Nup96 copie per poro. Utilizziamo la modellazione assistita dall'intelligenza artificiale in Alphafold per estendere il modello crio-EM esistente di Nup96 per individuare con precisione le posizioni delle etichette fluorescenti e mostrare che l'accuratezza della corrispondenza tra i dati fluorescenti e crio-EM è migliore di 3 nm nel piano e 5 nm fuori dal piano.

Il Complesso dei Pori Nucleari (NPC) è una macchina molecolare essenziale incorporata nell'involucro nucleare che collega il nucleo al citoplasma1,2,3. L'NPC agisce come una barriera di diffusione che separa il compartimento nucleare dal citoplasma e funziona come un passaggio per la regolazione genetica4,5. È indispensabile nei processi cellulari eucariotici come la regolazione del trasporto delle proteine ​​e della ribonucleoproteina4,6,7. La struttura e la composizione molecolare dell'NPC, in particolare dell'impalcatura, è stata ampiamente studiata. Precedenti studi di microscopia elettronica criogenica (crio-EM) e tomografia crioelettronica (crio-ET) hanno risolto la struttura dell'impalcatura NPC ad alta risoluzione1,2,3,8,9,10,11. Lo scaffold è composto da copie multiple di circa 34 diverse nucleoporine (Nups) e queste Nups sono organizzate in tre anelli12,13,14. Studi precedenti hanno dimostrato che l'anello citoplasmatico (CR) e l'anello nucleare (NR) sono composti da più cosiddetti complessi Y e che le proteine ​​Nup96 sono contenute in questi complessi Y10,15. Ogni anello contiene 16 molecole Nup96, organizzate in unità con simmetria rotazionale otto volte15,16,17.

La microscopia a super-risoluzione sta emergendo come tecnica complementare per lo studio della struttura biologica, poiché fornisce una risoluzione "diffrazionale illimitata"18,19,20. La microscopia di localizzazione di singole molecole (SMLM) è una di queste tecniche di super-risoluzione e ottiene immagini super-risolte con una risoluzione di 10-20 nm localizzando singoli emettitori fluorescenti18,21. Se si riescono a visualizzare molte strutture chimicamente identiche, chiamate particelle, è possibile registrarle e combinarle in un'unica "superparticella". Con questa strategia, il grado spesso scarso di marcatura di ogni singola particella può essere mitigato e si possono ottenere ricostruzioni con una risoluzione ancora migliore rispetto ai tipici 20 nm22,23,24,25. Diversi metodi di fusione delle particelle basati su modelli 2D sono stati applicati in SMLM per dimostrare la simmetria rotazionale otto volte dell'NPC22,26,27. Questi metodi, tuttavia, comportano il rischio di generare ricostruzioni con una preferenza per il modello. Successivamente, un approccio di registrazione 2D senza modello potrebbe rivelare la simmetria otto volte dell’NPC in modo imparziale28. Questo metodo senza modello è stato esteso al 3D e utilizzato per ricostruire la struttura 3D di Nup107 e Nup96 rivelando due anelli sfasati con otto macchie per anello29. Tuttavia, questo approccio 3D soffriva dell'artefatto del "punto caldo", che poteva essere mitigato solo applicando la conoscenza precedente sulla simmetria ottagonale in una fase di post-elaborazione. In un altro approccio di fusione delle particelle 3D, un modello viene adattato ai singoli NPC30 e le particelle vengono combinate in ordine di somiglianza nella superparticella. Questo approccio mostra anche due anelli con otto macchie o cluster ciascuno nella ricostruzione dell'NPC, come previsto, ma è interessante notare che alcune macchie sono allungate e inclinate nel piano degli anelli. Limitati dal loro elevato costo computazionale, né l’approccio di Ref.29 né quello di30 possono ricostruire migliaia di particelle in un tempo ragionevole. Recentemente abbiamo introdotto un approccio di fusione delle particelle veloce e senza template31 che supera la limitazione della velocità di calcolo, in modo che set di dati di diverse migliaia di particelle (o più) siano ora accessibili per l’analisi strutturale. Nel nostro approccio iterativo alla fusione veloce delle particelle31, ruotiamo e trasliamo tutte le particelle per adattarle a un modello di miscele gaussiane (GMM) utilizzando il metodo JRMPC (Joint Registration of Multiple Point Clouds)32 e successivamente aggiorniamo le posizioni e le larghezze dei centri gaussiani. In ogni ciclo di iterazione vengono aggiornati sia le particelle che il MGM. A causa delle limitazioni intrinseche del metodo di registrazione congiunta32, possiamo ottenere solo un allineamento localmente ottimale delle particelle che consistono in diversi cluster distinti con pose diverse. Quindi classifichiamo33 queste particelle allineate con pose diverse e le ricombiniamo per ottenere una soluzione globalmente ottimale costituita da un'unica struttura ben allineata.